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摘要：目的 探讨核酸检测技术应用于血液筛查的必要性。方法 选取2015年4月13日-2016年12月31日共122 261名无偿献血者，采用ELISA检测及核酸检测进行联合筛查，并对检测结果进行分析。结果122 261名无偿献血者标本中，共检测出 97份HBV DNA反应性和1份HIV RNA反应性，反应性率为0.08%，无HCV RNA检出；对14例HBV DNA和1例HIV1/2 RNA反应性献血者跟踪，跟踪样本进行ELISA和核酸检测，复检反应性11份（73.3%），无反应性4例（26.7%）。结论 核酸检测可缩短血液病毒检测“窗口期”，对艾滋病病毒提前检出及降低病毒隐匿性乙型肝炎感染从而有效地提高血液安全。关键词：核酸检测；HBV DNA、HCV RNA、HIV1/2 RNA；窗口期；血液筛查；输血安全 Abstract：Objective To explore the necessity of nucleic acid detection technology in blood screening . Methods A total of 122 261 blood donors from April 13, 2015 to December 31, 2016 were selected and analyzed by ELISA and nucleic acid detection. Results In 122 261 blood donors, 97 samples of HBV DNA reactivity and 1 sample of HIV RNA reactivity were detected, the reactivity ratio was 0.08 %, no HCV RNA was detected; 14 cases of HBV DNA and 1 case of HIV 1 / 2 RNA reactive blood donors were followed up, and the following samples were tested by ELISA and nucleic acid. 11 cases ( 73.3 % ) of HBV DNA and 4 cases ( 26.7 % ) of HIV 1 / 2 RNA reactive blood donors were rechecked.Conclusion Nucleic acid detection can shorten the " window period" of blood virus detection, which plays a certain role in early detection of HIV and reducing the risk of blood transfusion; There is a risk of HBV, HIV 1 / 2 RNA reactive transfusion in blood screening by enzyme-free technique alone. Key words：Nucleic acid detection; HBV DNA, HCV RNA, HIV 1 / 2 RNA; Window period; Blood screening; 中国是HBV高流行区，国家实施新生儿乙肝计划免疫项目后，人群中HBsAg流行率大幅下降[1-2]，但是随着人口流动频繁，艾滋病传播迅速发展，窗口期的存在，免疫静默，病毒变异，隐匿性感染等因素检测后的血液存在较高的残余风险[3]。核酸检测直接检测病原体基因组，能有效缩短病原体检测窗口期，减少病毒变异及隐匿性感染等造成的漏检，从而降低输血传播性疾病风险，保障血液安全[4]。 临沂市地处鲁东南，全国最大物流城，人口1100多万，流动性大，是艾滋病和各种传染病高发地区。为探讨临沂市核酸检测及血清学无反应性核酸检测反应性的献血者感染情况，对本站2015年4月13日-2016年12月31日核酸检测数据进行分析。本研究通过采用PCR的方法联合检测HBV DNA、HCV RNA 、HIV1/2 RNA，分析核酸检测结果与酶免技术检测结果的差异，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 标本来源 2015年4月13日-2016年12月31日临沂市中心血站采集无偿献血者血液标本122 261份，经检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2为单试剂反应性和无反应性标本进行HBV DNA、HCV RNA、HIV1/2 RNA三项联合核酸检测，试剂使用美国罗氏核酸检测系统进行6人份混样检测，混样反应性的进行单人份拆分检测。 1.2 仪器与试剂 Hamilton STAR IVD 7501全自动混样仪；COBAS AmpliPrep全自动核酸提取仪；COBAS TaqMan analyzer 全自动核酸扩增仪；Xantus全自动加样机；FAME全自动酶免分析仪。酶免检测试剂：乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒（英科新创，北京万泰）；丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（英科新创，北京万泰）；人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（北京万泰四代，珠海丽珠三代）试剂批批捡合格，均在有效期内使用。核酸检测试剂：cobasTaqScreen MPX Test，version 2.0，试剂批批捡合格，均在有效期内使用。 1.3检测方法 1.3.1标本准备 标本来源无偿献血者采后标本，分别留取3管，第一管EDTA-2K抗凝5ml真空管，用于酶免检测，第二管含分离胶EDTA-2K抗凝5ml真空管，用于核酸检测，第三管EDTA-2K抗凝2ml真空管，用于ALT检测，核酸检测管采后4小时内离心转速用离心力（2000g）、分钟（20min），2-10℃条件运输并交检验科。检验科采用2种不同厂家的酶免试剂进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2检测，将上述三项双试剂无反应性及单试剂反应性标本于72h内完成核酸检测。 1.3.2混样核酸检测 采用罗氏核酸检测系统进行检测。 1.3.3拆分单检 对混样检测有反应性的标本进行单检，每个标本吸取1000μl血浆进行提取和扩增。如果单检结果为检测项目有反应性时，则判定为该项目反应性，如果单检结果无反应性，则判定为HBV DNA、HCV RNA、HIV1/-2 RNA 三项无反应性。 1.3.4跟踪标本检测 每次跟踪标本均进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2酶免检测和混样核酸检测或单检核酸检测。 2 结果 2.1酶免检测结果（表1）。 表1酶免检测结果
2.2核酸检测筛查结果 （表2）。 表2核酸检测结果
2.3 15例HBV DNA反应性的愿意配合复查的献血者采集标本进行核酸和酶免同时检测（表3）。 表3 15例献血者HBV DNA跟踪检测情况
表4一例HIV RNA反应性献血者跟踪情况
表5一例HBV DNA反应性献血者跟踪情况
表6 酶免单反应性和无反应性核酸检测对比
3 讨论 从表2核酸检测结果来看，122 261份经ELISA检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2后，121978份单试剂反应性和非反应性的标本核酸检测出反应性98份，反应性率0.08%，同我国其他地区报道的数据[5-7]一致,见表2。共检测20748个混样pool，检出158个HBV DNA反应性混样pool和1个HIV RNA反应性混样pool，混样pool反应性率为0.77%；混样pool反应性拆分率62%，与临检中心统计报道相符。随着NAT检测试剂自身灵敏度的不断提高 , 核酸检测的检出率将更高。 从表3发现，随机跟踪的HBV DNA反应性复检反应性率为73.3%，符合率高，无反应性率为26.7%，由于技术操作及试剂原因造成无反应性[8]；本次跟踪献血者都为男性，年龄在50岁左右，HBV DNA反应性由于免疫静默，病毒变异，隐匿性感染有关。 一例献血者献过4次血，没有开始核酸检测前，ELISA检测均无反应性，第5次献血时核酸检测HIV1/2 RNA反应性，CT值为29.7 ，ELISA检测无反应性。4d后第一次跟踪该献血者，核酸检测HIV1/2 RNA反应性，CT值19.2，ELISA方法检测无反应性，确证试验无反应性；16d后第二次跟踪该献血者， HIV1/2 RNA反应性，CT值14.8，ELISA艾滋病三代试剂S/CO为0.65判定为无反应性，艾滋病四代试剂S/CO1.05判定为反应性，确证试验无反应性。39d后第三次跟踪该献血者，核酸检测HIV1/2 RNA反应性，CT值20.9，ELISA艾滋病三代试剂S/CO9.15判定为反应性，艾滋病四代试剂S/CO10.6判定为反应性，确证实验反应性，HIV确证实验比核酸检测晚39d。从核酸检测CT值看，HIV病毒在1010、105倍复制，随着HIV抗体增加，病毒受到抑制复制减慢，结果见表4。一例献血者献过2次血，没有开始核酸检测前，ELISA检测均无反应性，第3次献血核酸检测HBV DNA反应性，CT值30.1，ELISA检测无反应性。15d后跟踪该献血者，ELISA检测两种国产试剂S/CO均为10.6，判定为HBV反应性，核酸检测单检CT值24.1，HBV病毒量增加106 倍， HBV病毒在复制期，结果见表5。据报道HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶联免疫检测窗口期分别为45d、72d、22的。有研究表明，混合血样核酸检测可将HBV、HCV、HIV感染的平均“窗口期”分别缩短9d、59d、11d[9]。从表4中核酸检测看艾滋病病毒一旦进入体内在短时间内复制速度成倍增长，在产生大量抗体时有抑制作用，HIV酶免检测四代试剂要比三代试剂提前11d检出，核酸检测要比酶免HIV四代试剂提前16d检出。从表5中看HBV DNA核酸检测比酶免检测提前15d。这与报道是相符的。但是由于跟踪标本数少，需要进一步扩大标本量。 从表1和表5发现，酶免检测单试剂反应性共531份，其中HBsAg188份，抗-HCV263份，抗-HIV1/2 80份的献血者标本进行核酸检测，98份核酸反应性中有2份是单试剂反应性，都是HBV DNA反应性，反应性率为2.04%， 单试剂反应性抗-HCV、抗-HIV1/2核酸检测都无反应性，单试剂反应性比无反应性核酸检出率要高。血清学筛查试剂的灵敏度越高、对变异株的检出能力越强，血清学漏检的风险就越小，NAT检测的作用就越小反之，患者出现输血后感染疾病的风险已经很低， HBsAg检测无反应性所致的HBV输血感染占较大的比例。HBsAg检测无反应性的窗口期感染的献血者血液或HBsAg检测无反应性HBcAb反应性的献血者血液，可以导致受血者感染HBV，单采用酶免技术进行血液检测存在HBV的漏检，对输血安全造成隐患。 核酸检测技术是直接检测病原体核酸的一系列技术总称，是通过采用分子诊断技术直接检测病原体核酸的方法[10]，有高敏感性，特异性和高度自动化的特点 [11]，可缩短血液病毒检测“窗口期”，对艾滋病病毒提前检出及降低病毒隐匿性乙型肝炎感染减低输血风险起到一定作用，为避免酶免检测漏检风险，核酸检测和酶免检测能互为补充是科学的方案，从而降低输血风险，保障血液的安全，因此核酸检测技术应用于献血者血液筛查是必要的和可行的。 参考文献 [1] Chang MH.Hepatitis B virus infection.semin Fetal Neonatal Med，2007，12（3）:160-167. [2] Liang X,BiS,YangW,etal.Epidemiologicalserosurvey of hepatitis B in China-declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination.Vaccine，2009,27（47）:6550-6657. [3]李雪梅，春茂，春晴，等.献血者HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TPELISA检测反应性与确正试验的对比研究.中国输血杂志，2013,26（6）:541-543. [4]杨刚，马晓军，杨文勇，等.核酸检测技术在基层血站血液筛查中应用. 中国输血杂志，2016,29（11）:1249-1251. [5]李莉华，韩卫，何路军，等. 石家庄地区2012-2014年献血人群NAT检测情况分析. 中国输血杂志,2015, 28 (6) : 683-685 [6]何亚琴，张建伟，杨爱龙，等.核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用. 中国输血杂志，2011,24（7）:560-562. [7]叶贤林，李活，许晓绚，等.核算扩增技术在献血者血液HBVDNA、HCVRNA及HIV-1RNA筛查中的应用研究. 中国输血杂志，2010,23（1）:6-10. [8]颜秀娟，陆祝选，邱昌文，等.核酸检测技术应用于血清学筛查合格的献血者标本检测. 中国输血杂志，2012，27（12）：1322-1323. [9]曾劲峰，杨宝成.血液筛查核酸检测的建立及应用.中国输血杂志，2008, 21（11）:827-828. [10]吴丹霄，吴亚玲，吕杭军.核酸检测在献血筛查中的应用.江苏预防医学。2015，27（5）：501-503. [11]任芙蓉.核酸检测技术在国内外血液筛查中的应用.北京医学，2008，30（8）：561-564. |
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